Zymomonas mobilis Ndh kofaktoru specifiskuma mainīšana izmantojot sait-specifisko mutaģenēzi
Author
Balodīte, Elīna
Co-author
Latvijas Universitāte. Bioloģijas fakultāte
Advisor
Kalnenieks, Uldis
Date
2014Metadata
Show full item recordAbstract
Lai pētītu Zymomonas mobilis NAD(P)H dehidrogenāzes substrātu specifiskumu un aktivitāti, izveidots plazmīdas konstrukts ar ndh gēnu. Izmantojot sait-specifisko mutaģenēzi iegūts ndh gēna mutantais variants. Tā produktā (Ndh) 220 pozīcijā Glu nomainīta uz Gln. Veikta Zm6-ndh komplementācija ar natīvo ndh gēnu un tā mutanto variantu.
Izmantojot membrānu vezikulas, mērīta NAD(P)H dehidrogenāzes aktivitāte, par elektronu donoriem izmantojot NADH vai NADPH.
Mutantās Ndh kinētikas analīze parādīja, ka šim enzīmam ir samazināta Km vērtība par substrātu izmantojot NADPH, pieaugusi attiecība VmaxNADPH/VmaxNADH ,bet absolūtā aktivitāte uz abiem kofaktoriem ir samazinājusies.
Audzēšanas eksperimentos parādīts, ka Ndh aktivitāte negatīvi korelē ar augšanas ātrumu.
Maģistra darbs izstrādāts Latvijas Universitātes Mikrobioloģijas un Biotehnoloģijas institūtā.
Atslēgas vārdi: NAD(P)H dehidrogenāze, Zymomonas mobilis, elpošanas ķēde, sait-specifiskā mutaģenēze In order to study the substrate specificity and activity of Zymomonas mobilis NAD(P)H dehydrogenase, a plasmid construct, containing ndh gene, was made. Site-specific mutagenesis was used for obtaining the mutant ndh gene variant. Its product (Ndh) contains Glu replaced by Gln at position 220. Zm6-ndh was complemented with native ndh gene and its mutated version.
Membrane vesicles was used for measuring the NAD(P)H dehydrogenase activity, using NADH or NADPH as electron donors.
Kinetic analysis of the mutated Ndh showed, that this enzyme has reduced Km value, when using NADPH as the substrate, VmaxNADPH/VmaxNADH ratio has grown, but the activity to both kofactors has decreased.
It was shown in the cultivation experiments, that Ndh activity has a negative correlation with the growth rate.
The work was carried out at the Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Latvia.
Keywords: NAD(P)H dehydrogenase, Zymomonas mobilis, respiratory chain, site-specific mutagenesis