Glicerīna cikla ietekme uz maizes rauga šūnu fenotipu

Abstract

Šī darba mērķis bija novērtēt redoks kofaktora NADPH inženierijas mēģinājuma ietekmi uz rekombinantu Saccharomyces cerevisiae celmu fenotipu eksponenciālās augšanas laikā. Šajos CEN.PK2-1C rekombinantajos celmos tika ekspresēta NADP+ atkarīga glicerīna dehidrogenāze (Gld2p) ar mērķi atgriezt daļu glicerīna glikolīzē, kombinācijā ar glutationa antioksidatīvās sistēmas un NADPH kofaktora reģenerāciju. Rekombinantajiem celmiem tika noteikta subletālo stresu noturība, NADPH/NADP+ kofaktora un GSH/GSSG savstarpējās relatīvās attiecības, izmantojot spektrofotometriju un fluorometriju, kā arī rekombinantu augšanas dinamika ar ksilozi kā vienīgo oglekļa avotu. Darbā novērots, ka izveidotais „glicerīna cikls” nenoved pie vēlamā, stresa izturīgā fenotipa rašanās. Netika novērota paaugstināta NADPH un reducētā glutationa sintēze. Netika novērotas arī būtiskas izmaiņas augšanas ātrumā un dinamikā. Oksidatīvā stresa testi norāda uz iespējamu raugu citozīna deamināzes (Fcy1p) nozīmi pie stresa noturības. Stresa noturības kontekstā, ievērojamākais efekts tika panākts celmos ar izslēgtu ade8 gēnu. Veiktās modifikācijas neietekmē ksilozes metabolismu rekombinantajos celmos. Iegūtie in vivo rezultāti apstiprina termodinamiskos aprēķinus par reakcijas glicerīns – dihidroksiacetons nepieciešamajiem nosacījumiem. Lai gan šī reakcija norit in vitro pH > 8,8, šūnā esošā fizioloģiskajā pH dominē pretējā reakcija.

The aim of this work was to evaluate the effect of a NADPH redox cofactor engineering attempt on a recombinant Saccharomyces cerevisiae strain phenotype, during the exponential growth phase. In CEN.PK2-1C recombinant strains, NADP+ dependent glycerol dehydrogenase (Gld2p) was expressed with the aim to return some of the produced glycerol to glycolysis while at the same time regenerating the glutathione antioxidative system and cofactor NADPH. The sublethal stress tolerance was evaluated for the recombinant strains also NADPH/NADP+ cofactor and GSH/GSSG relative ratios were determined with the use of spectrophotometry and fluorometry. Also the growth of recombinant strains on xylose as the single carbon source was evaluated. It was observed that the designed "glycerol cycle" did not produce the desired stress resistant phenotype. Increased NADPH and glutathione synthesis was not observed. No relevant changes in the growth rate and dynamics were observed. The oxidative stress test results indicated a possible yeast cytosine deaminase (Fcy1p) role in stress tolerance. In the context of stress tolerance, the most noteworthy effect was achieved in strains with a disabled ade8 gene. The modifications did not affect xylose metabolism in the recombinant strains. The obtained in vitro results confirm the thermodynamic calculations about the necessary conditions for glycerol - dehydroxyacetone reaction. Despite the fact that the reaction does take place in vitro at pH > 8,8, the opposite reaction dominates in the pH present in yeast cell's.