Jauna pieeja prostatas vēža cirkulējošu ekstracelulāro vezikulu selektīvai izolēšanai un to ietverto RNS biomarķieru analīze

Abstract

Audzēju producētās ekstracelulārās vezikulas (EVs) ir ieguvušas ievērojamu uzmanību zinātnieku vidū pēdējo gadu laikā, kā daudzsološs biomarķieru avots ar potenciālu pielietojumu vēža diagnostikā, prognostikā un monitorēšanā. Pacientu biofluīdos cirkulējošo EV izmantošanu šiem mērķiem apgrūtina tas, ka vēža izcelsmes EVs bieži sastāda zemu proporciju no kopējā parauga EV satura un šī proporcija mēdz atšķirties pacientu starpā. Tādēļ vajadzīgs meklēt jaunas pieejas, kas ļautu selektīvi izolēt un analizēt noteiktas EV subpopulācijas, kas bagātinātas ar vēža izcelsmes biomarķieriem. Adresējot šo aktualitāti, bakalaura darbā tika attīstīta un testēta jauna EV subpopulāciju izolēšanas metode – ar antivielām noklātu magnētisko nanodaļiņu (MNP) izmantošana. Konjugēšanai ar MNP tika izmantotas antivielas pret PSMA (prostatas specifisks marķieris) un CD63 (universāls EV marķieris) un, testējot konstruktus ar bioreaktorā ģenerētām PSMA+ LNCaP līnijas EVs, apstiprināts, ka tie ar augstu efektivitāti spēj piesaistīt attiecīgās EV populācijas. Tālākie rezultāti liecināja, ka imunoafīni izolētas PV pacientu urīna EVs satur augstāku mērķa subpopulācijas līmeni, nekā ar SEC izdalītā EV populācijā. Sākotnējie ddPCR testi apstiprināja PV marķiera miR-375 klātbūtni imunoafīni izlolētās PV pacientu urīna EV subpopulacijās.

Tumour-produced extracellular vesicles (EVs) have gained considerable attention among scientists in recent years as a promising source of biomarkers with potential applications in cancer diagnosis, prognosis and monitoring. The use of EVs circulating in patients' biofluids for these purposes is complicated by the fact that EVs of cancer origin often represent a low proportion of the total EV content of the sample and this proportion tends to vary between patients. Therefore, new approaches are needed to selectively isolate and analyse specific subpopulations of EVs enriched in biomarkers of cancer origin. To address this need, a novel method for isolating EV subpopulations, the use of antibody-coated magnetic nanoparticles (MNPs), was developed and tested in a bachelor thesis. Antibodies against PSMA (prostate specific marker) and CD63 (universal EV marker) were used for conjugation to MNPs and the constructs were tested with bioreactor generated PSMA+ LNCaP line EVs and confirmed to be able to recruit target EV populations with high efficiency. Further results showed that immunoaffinity-isolated urinary EVs from PV patients contained higher levels of the target subpopulation than the SEC-isolated EV population. Preliminary ddPCR assays confirmed the presence of the PV marker miR-375 in immunoaffinity isolated PV patient urinary EV subpopulations.