Alfavīrusu genomiskās RNS piegāde audzēju šūnu kultūrās, izmantojot lipofilos 1,4-dihidropiridīna atvasinājumus

Abstract

Alfavīrusu genoms ir aptuveni 11,5 kb gara vienpavediena, pozitīvas ķēdes RNS, kuru ir potenciāls izmantot antigēnu kodējošu, pašamplificējošu RNS vakcīnu izstrādē. Lai veidotu stabilu piegādes sistēmu bieži tiek izmantoti lipofili aģenti ar katjonu īpašībām, piemēram, 1,4-dihidropiridīna atvasinājumi. Šādi lipopleksi jau ir uzrādījuši teicamus rezultātus nukleīnskābju vakcīnu preparātu izstradē. Salīdzinot ar virālajām piegādes sistēmām, tiek apietas problēmas, kas saistītas ar anti-vektora imunitāti, citotoksicitāti un biodrošību. Šajā darbā tika veikta alfavīrusu genomiskās RNS rekSFV1/Ds-Red un 1,4-dihidropiridīnu atvasinājumu lipopleksu veidošanas optimizācija, lai panāktu maksimāli efektīvu nukleīnskābju iepakošanu un izvairītos no lieka citotoksiskā efekta. Izmantojot MTT testu, tika noteikta transfekcijas reaģentu citotoksitātu. Lipopleksu izmēri tika noteikti ar dinamiskās gaismas izkliedes sistēmu. Lai uzzinātu lipopleksa daudzumu, kas nepieciešams, lai panāktu potenciāli augstāko transfekcijas efektivitāti tika veiktas transfekcijas B16-F10, 4T1 un TS/A audzēju šūnu kultūrās ar lipopleksu šķīdumiem, kuri saturēja 0,5;1,0;1,5;2,0 g rekombinantās alfavīrusu RNS, kura kodē sarkano fluorescento proteīnu Ds-Red. Transfekciju efektivitāte tika vērtēta vizuāli, izmantojot fluorescences mikroskopiju un detktējot Ds-Red ekspresiju un kvantitatīvi ar plūsmas citometrijas analīzi. Visaugstākās efektivitātes tika sasniegtas, piegādājot šūnām 1 g RNS. TS/A un B16-F10 gadījumā efektivitāte bija zema, bet 4T1 šūnās tika detektēta aptuveni 35%-50% šūnu Ds-Red ekspresija. Papildus tika veiktas šūnu kultūru infekcijas ar rekombinanto vīrusu SFV1/Ds-Red un transfekcijas ar komerciālo reaģentu Lipofectamine 2000, rezultāti liecināja, ka virālā metode nodrošina visaugstāko transfekcijas efektivitāti. Lipofectamine 2000 transfekcijas efektivitāte TS/A un B16-F10 tik pat zema, kā eksperimentos ar 1,4-dihidropiridīnu atvasinājumiem, bet 4T1 zemāka nekā ar lipofilajiem transfekcijas reaģentiem, kas liecina par 1,4-dihidropiridīna atvasinājumu konkurētspēju ar plaši pielietotu, komerciālu reaģentu. Tika secināts, ka lipofilajiem 1,4-dihidropiridīna atvasinājumiem ir potenciāls pašamplificējošas RNS piegādes pētījumiem 4T1 audzēju modelī in-vivo.

Alphavirus genome is 11,5 kb long single-stranded positive RNA, which has potential to be a vector for self-amplifying RNA vaccine development. Lipophilic agents with cation properties, such as 1,4-dihydropyridine derivatives, are often used to create stable delivery systems. These kind of lipoplexes are showed remarkable results for nucleic acid transfer and vaccine development. In comparison to viral delivery methods, problems like anti-vector immunogenecy, cytotoxicity and biosafety concerns are avoided. In this research we carried out optimization of alphavirus genomic RNA recSFV1/Ds-Red and 1,4-dihydropyridine derivative lipoplex formation, to achieve effective nucleic acid encapsulation and to obviate from unnecessary cytotoxic effect. To evaluate cytotoxicity of transfection reagents MTT test was used. Dynamic light scattering system was applied to determine sizes of transfection complexes. To find out optimal quantity of lipoplex amount needed for effective transfection procedure into B16-F10, 4T1 and TS/A cells, we transfected cells with multiple lipoplex dilutions which contained 0,5;1,0;1,5 and 2;0 g of alphaviral RNA which encodes Ds-Red (red fluorescent protein-RFP). Efficiency of transfection was determined with fluorescence microscopy and quantitavely by FACS analysis for detection of RFP. Most effective transfection was attained with transfection complexes which carried 1 g of RNA. In TS/A and B16-F10 tumor cell lines transfection rates were low, but in 4T1 cell we observed transgene expression in 35%-50% of transfected cells. In addition we infected cell lines with SFV1/Ds-Red and transfected cells using Lipofectamine 2000. Results showed that viral gene delivery method ensured the highest expression rates. In B16-F10 and TS/A lines transfected with lipofectamine transgene expression was as low as with 1,4-dihydropyridine derivatives, but in 4T1 it was significantly lower. These results points to the fact that 1,4-dihydropyridine derivatives are able to show competitive abilities with widely used, commercial transfection reagent. From data presented in this research we concluded that lipophilic 1,4-dihydropyridine derivatives has potency to be used in further research for RNA delivery in 4T1 models in-vivo.