N-galā ieviestas hemaglutinīna iezīmes ietekme uz melanokortīnu receptoru daudzumu šūnas membrānā

Abstract

Darbā tika veikta ar hemaglutinīna (HA) iezīmi N-galā un zaļo fluorescento proteīnu (GFP) C- galā sajūgtu melanokortīna 2. tipa (MC2R) un 4. tipa (MC4R) sekvenču kodējošu ekspresijas plazmīdu izveide. Jauniegūtajiem receptoriem tika noteikta funkcionālā aktivitāte CHO (Chinese Hamster Ovary cells) šūnās, lai pārliecinātos par to atbilstību izmantošanai receptoru šūnu virsmas ekspresijas mērījumos. Darba mērķis bija izmantot šos receptorus, lai pārbaudītu HA iezīmes un GFP ietekmi uz receptoru CHO virsmas ekspresiju, izmantojot konfokālo lāzerskenējošo mikroskopiju un imunofluorescento testu attiecīgi. Darbā tehnisku sarežģījumu dēļ netika pārbaudīta GFP ietekme, bet novērotā HA ietekme mazina iespēju, ka tāda eksistē. Tika noteikts, ka HA iezīme statistiski būtiski paaugstina MC2R šūnas virsmas ekspresiju, kamēr MC4R ekspresiju tā neietekmē. HA iezīmes ietekme uz MC2R virsmas ekspresiju pārsniedz tā palīgproteīna MRAP ietekme. Hemaglutinīna iezīmes ieviešana rada artifaktu, jo abnormāli paaugstina MC2R daudzumu membrānā, šajā gadījumā to nevar izmantot, lai raksturotu šo parametru kā normālos apstākļos esošu. Metodes receptoru daudzuma mērīšanai ar peptīdu iezīmes ieviešanu nepieciešams validēt ar citām metodēm.

During this study construction of expression plasmids containing sequences of the N-terminal hemaglutinin (HA) tagged melanocortin type 2 (MC2R) and type 4 (MC4R) receptors with fused green fluorescent protein (GFP) in the C-terminus was performed.The functional activity of these receptors was tested in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells and confirmed. Goal of this thesis was to use these receptors to measure the effects of the HA tagand the GFP on receptor membrane turnover by carrying out enzyme-linked imunosorbent assay and confocal laser scanning microscopy imaging accordingly. Due to technical complications the effects of GFP was not determined, but observed effect of the HA tag diminishes the possibilty of it. Statistically signigicant effect of HA tag was measured as it increased the MC2R surface expression, while it did not affect membrane turnover of MC4R. The stimulatory effect of the N-terminal HA tag exceeded the one of elevating the membrane turnover of MC2R associated protein (MRAP) in CHO cells. Tagging N-terminus with the HA peptide creates an artifact, because it abnormaly increases the membrane turnover of the MC2R, in this system it can not be used to characterise this parameter as in normal conditions.Methods for measuring membrane turnover using epitope tags should be validated with different techniques.