Melanokortīna otrā tipa receptora un tā palīgproteīna ekspresija rauga Pichia Pastoris ekspresijas sistēmā

Abstract

Darba ietvaros tika izveidots pPIC9K- MC2R-T4L ekspresijas konstrukts, kas tika ekspresēts P.Pastoris sistēmā. Western blot analīze uzrādīja nepieciešamās molekulmasas zonu. MC2R-T4L izdevās attīrīt uz His- un Ha-tag afinitātes kolonnām. Lai noteiktu funkcionāla MC2R struktūru, to nepiecieciešams ekspresēt kompleksā ar MRAP, tādēļ tika izveidoti vairāki MC2-MRAP konstrukti, ko tālāk izmantot proteīna ekspresijai P. Pastoris šūnās. To aktivitāte tika pārbaudīta zīdītāju šūnu līnijās nosakot cAMP daudzuma izmaiņas pēc stimulācijas ar ACTH (1-24). Iegūtie rezultāti bija nestabili, tādēļ tālākajos pētījumos tiks veikta radioaktīvā ACTH saistīšanas mērījumus. Darbs tika veikts no 2013.gada jūnija līdz 2015. gada jūnijam Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā.

During the course of the work pPIC9K- MC2R-T4L construct was created and used for protein production in yeast P.Pastoris expression system. Western blot analysis displayed presence of protein band with according molecular weight. Protein was purified using His- and Ha-tag affinity columns. MC2R can be activated only when coexpressed with MRAP. For this reason we created several MC2-MRAP constructs, which shall be further used for protein expression in P.Pastoris. Activity of the complex was evaluated in mammalian cell lines, by estimation of cAMP response upon stimulation with ACTH(1-24). Acquired results were not reproducible, thus it was decided to conduct radioactive ACTH binding measurements. Work was carried out from June 2013 to June 2015 in Latvian Biomedical Research and Study Centre.