Modificētu enzīmu dizains proteīnu deglikācijai: jauno amadoriāzes enzīmu producēšana un raksturošana

Abstract

Fruktozilpeptīdoksidāzes (FPOx) ir deglikējoši enzīmi, kas tiek izmantoti glikētā hemoglobīna (HbA1c) mērīšanai diabēta diagnostikas testos. Tomēr šie enzīmi nereaģē ar veseliem glikētiem proteīniem saistībā ar to šauro tuneli, kas ved uz katalītisko daļu. Līdz ar to ir nepieciešams veikt iepriekšēju proteolītisku HbA1c šķelšanu, lai veidotu mazākus glikētus peptīdus. Šī darba mērķis ir ekspresēt, attīrīt un strukturāli raksturot trīs amadoriāzes mutantus (A2, A14 and D18), kā arī references enzīmu AnFPOX-47, kas līdz šim ir vienīgais zināmais amadoriāzes mutants, kas uztver glikētu hemoglobīnu. Jaunie amadoriāzes mutanti tika veiksmīgi ekspresēti, attīrīti un raksturoti ar bioķīmiskiem un biofizikāliem testiem. Tomēr tie neuzrādīja augstāku termostabilitāti un enzimātisko aktivitāti pret lielākiem substrātiem, salīdzinot ar savvaļas tipa enzīmu.

Fructosyl peptide oxidases (FPOx) are deglycating enzymes that are used for the measurement of glycated hemoglobin (HbA1c) in diabetes diagnostic assays. However, due to their buried active site, these enzymes cannot directly detect whole glycated proteins, making it necessary for a target protein to undergo a preliminary proteolytic step to generate small detectable glycated peptides. The aim of this thesis is to express, purify and characterize three amadoriase mutants (A2, A14 and D18), together with a reference mutant (AnFPOX-47) that has been reported to be active on glycated hemoglobin. The new mutants were successfully expressed, purified and analyzed biochemically and biophysically. However, they showed neither a higher thermal stability nor enhanced enzymatic activity towards large substrates compared to their wild type form.