Glicerīna transportsistēmas un Hog1 loma raugu šūnu dzīvotspējas saglabāšanā anhidrobiozes stāvoklī

Abstract

Šī darba mērķis bija izpētīt glicerīna transportsistēmu un Hog1p iespējamo lomu raugu šūnu dzīvotspējas saglabāšanā anhidrobiozes stāvoklī. Lai sasniegtu šo mērķi, izmantoja raugu Saccharomyces cerevisiae BY4741 un tā izogēnos celmus, kuriem trūka viens vai vairāki gēni, kuri ir atbildīgi par glicerīna transportiera Stl1p, glicerīna eksporta kanāla Fps1p un regulatorās Hog1p MAP kināzes ekspresiju raugu šūnās.

Darbam bija izvirzīti sekojošie uzdevumi: izpētīt S. cerevisiae BY4741 spējas pāriet anhidrobiozes stāvoklī; novērtēt glicerīna transportsistēmu Stl1p un Fps1p, ka arī Hog1p ietekmi uz raugu šūnu rezistenci pret dehidratāciju; izpētīt raugu spējas pārdzīvot osmotisko stresu un šīs iedarbības ietekmi uz šūnu spējām pārdzīvot dehidratācijas stresu.

Visus raugu celmus varēja izmantot anhidrobiozes pētījumiem; tiem nekonstatēja izmaiņas šūnu morfoloģijā, sasniedzot stacionāro augšanas fāzi ar 98 - 100% dzīvotspēju. Izejas celms S. cerevisiae BY4741 var saglabāt 45% dzīvotspēju pēc dehidratācijas, ja mitrums ir 10 - 11%. Pirmo reizi atklāja, ka glicerīna transportierim Stl1p ir nozīmīga loma raugu šūnu dzīvotspējas saglabāšanā anhidrobiozes stāvoklī. Hog1p kināzes trūkums raugu šūnās būtiski samazina to izturību pret dehidratācijas iedarbību. Bet rauga celms ar glicerīna eksporta kanāla Fps1p delēciju pēc dehidratācijas saglabāja šūnu dzīvotspēju līdzīgu izejas celmam. Rauga mutants hog1Δstl1Δfps1Δ nav spējīgs pārdzīvot dehidratāciju. Meklējot iespējamo skaidrojumu iegūtajiem datiem, novēroja, ka raugu mutantu zemā dzīvotspēja pēc dehidratācijas korelēja ar zemo trehalozes daudzumu šūnās pirms dehidratācijas. Papildus konstatēja, ka šūnu reaktivācija no anhidrobiozes stāvokļa, izmantojot lēno rehidratāciju, būtiski paaugstina šūnu dzīvotspēju. Atklāja, ka aizvietojot glikozi kā oglekļa avotu ar glicerīnu, visu raugu celmu rezistence pret dehidratāciju nozīmīgi paaugstinājās. Visi raugu celmi bija spējīgi pārdzīvot osmotisko stresu, kas saistīts ar biomasas inkubāciju šķīdumos ar 1 M NaCl, KCl, glicerīnu un 2 M sorbitolu. Pēc šūnu pakļaušanas šādai iedarbībai, visiem raugu celmiem paaugstinājās šūnu dzīvotspēja pēc dehidratācijas, it īpaši paraugiem, inkubētiem glicerīna un sorbitola šķīdumos.

Maģistra darbā ir 64 lappuses, 19 attēli, 13 tabulas un 97 informācijas avoti.

The aim of this research was to study the possible role of glycerol transport systems and Hog1p in the maintenance of yeast cell survival in the state of anhydrobiosis. To achieve the goal of this work the yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 and it’s isogenic strains lacking one or more genes encoding the Stl1p glycerol importer, the Fps1p glycerol exporter and regulatory Hog1 MAP kinase were used.

The following tasks were set up: to investigate the ability of S. cerevisiae BY4741 to be transferred into the state of anhydrobiosis; to evaluate the influence of Stl1p and Fps1p glycerol transport systems and Hog1p on the yeast cell resistance to dehydration; to study the abilities of yeasts to survive under the osmotic stress and the influence of this treatment on the cells resistance to dehydration.

All yeast strains were used for the investigations of anhydrobiosis; the changes in the morphology of cells were not obtained during the stationary phase of growth and viability of all strains was about 98 - 100%. Wild strain S. cerevisiae BY4741 maintains 45% of viable cells after dehydration if humidity of cells is 10 - 11%. For the first time it was shown that Stl1p glycerol transporter has a crucial role in the maintenance of cells viability during the state of anhydrobiosis. The deletion of Hog1p kinase significantly decreases cells resistance to dehydration. But the yeast mutant with deletion of Fps1p glycerol exporter had the same viability of cells after dehydration as the wild type. Yeast mutant hog1Δstl1Δfps1Δ is not able to survive during dehydration. To find out the possible interpretation of acquired results, it was obtained, that the low viability of yeast mutants during dehydration correlated with the low content of trehalose in the intact cells before dehydration treatment. In addition it was established that reactivation of cells from the state of anhydrobiosis using the slow rehydration significantly increases the viability of cells. It was shown, that replacement of glucose with glycerol in the growth medium can improve the resistance of cells to dehydration. All yeast strains survived during the osmotic stress connected with the incubation of biomass in solutions with 1 M NaCl, KCl, glycerol and 2 M sorbitol. After treatment with osmotic stress viability of cells after dehydration increased, especially it was obtained in samples treated with glycerol and sorbitol.

The research work contains 64 pages, 19 figures, 13 tables and 97 literature sources.