FRET fluorescento proteīnu balstītu pH sensoru izveide

Abstract

Iekššūnas vides pH ir būtisks parametrs, kas raksturo šūnā notiekošos procesus, kā arī šūnas vitalitāti. Fluorescento proteīnu pielietošana pH noteikšanai ir daudzsološa metode. Pieejami atšķirīgas pH jutības fluorescentie proteīni, tie neuzrāda augstu toksicitāti un invazivitāti, padarot tos piemērotus dzīvu šūnu pētījumiem. Maģistra darba mērķis bija izveidot fluorescento proteīnu saturošus konstruktus ar atšķirīgu pH jutības slieksni, izmantojot Aquamarine, ECFP, EYFP un Citrine fluorescentos proteīnus, kas darbosies kā pH sensoru sistēma dzīvās šūnās, izmantojot FRET metodi. Trīs konstrukciju izveide (pAqua-HL3-Citrine, pAqua-HL3-EYFP, pECFP-HL3-EYFP) veikta ar dažādām metodiskajām pieejām. Pielietota vairāku fragmentu vienlaicīga ligēšana un ķīmiski sintezēta fragmenta izmantošana, kurš satur fluorescento proteīnu gēnus, ar un bez tā amplifikācijas pirms ligēšanas. Vairāku fragmentu ligēšanas rezultātā konstrukcija neizveidojās, savukārt ķīmiski sintezētais fragments veiksmīgi ieligējās vektorā un tika iegūtas rekombinantas E.coli baktēriju kolonijas. Sekvencēšanas rezultāti liecina, ka gēnu konstrukta sintēzes produktu nav ieteicams amplificēt mutāciju rašānās dēļ PĶR laikā. Izveidoto konstruktu fluorescences pārbaude plašā lauka mikroskopā norādīja uz traucētu gēna ekspresiju. Secinājums: Izveidoto konstrukciju analīze liecina par atsevišķu plazmīdu reorganizāciju transformācijas rezultātā. Turpmāk paredzēts veikt baktēriju koloniju PĶR un restrikcijas analīzi, pareizi izveidota konstrukta identificēšanai.

Intracellular pH is an essential parameter, which characterizes cell’s inner processes as well as the vitality of the cell. The use of fluorescent proteins for pH detection is a promising technique. The fluorescent proteins are available with various pH-sensitivity levels, they do not show high toxicity and invasiveness, making them suitable for live cell research. The aim of the master thesis was to create fluorescent protein-containing constructs with a different pH-sensitivity threshold using Aquamarine, ECFP, EYFP, and Citrine fluorescent proteins, which would act as a pH sensor system in live cells, using the FRET method. The development of three constructs (pAqua-HL3-Citrine, pAqua-HL3-EYFP, pECFP-HL3-EYFP) was performed with various methodological approaches. Simultaneous ligation of multiple fragments has been used, and use of chemically synthesized fragment, which contains fluorescent protein genes, with and without amplification prior ligation. As a result of multiple fragment ligation, construct did not develop, while the chemically synthesized fragment successfully ligated into vector and colonies of recombinant E. coli were obtained. The sequencing results indicate that it is not recommended to amplify gene construct due to mutation risk during PCR. The fluorescence analysis of the constructs with wide-field microscope indicated restricted expression of the gene. Conclusion: An analysis of the created constructs indicates reorganization of individual plasmids as a result of the transformation. Henceforth, a bacterial colony PCR and restriction analysis are planned for the identification of the correct constructs.