Āra bērza Betula pendula rejuvenilizāciju ietekmējošie faktori audu kultūrā

Abstract

In vitro kultūras uzsākšana un dzinumu rejuvenilizācija no reproduktīvajā fāzē esošiem bērziem ir apgrūtināta un bieži vien nav veiksmīga. Līdz šim nav izstrādāti ne fizioloģiskie, ne molekulārie marķieri bērzu in vitro dzinumu juvenilitātes pakāpes novērtēšanai, kas ļautu izsekot rejuvenilizācijas procesam un noskaidrot tā ietekmējošos faktorus. Darbu veica ar mērķi noskaidrot āra bērza in vitro dzinumu rejuvenilizāciju ietekmējošos faktorus audu kultūrā un izstrādāt fizioloģiskos un molekulāros āra bērza juvenilitātes marķierus. Darbā noteica subkultūras ilguma, slāpekļa un saharozes koncentrācijas un augu augšanas regulatoru ietekmi uz nostabilizētu bērza in vitro dzinumu rejuvenilizāciju, to raksturojot ar morfoloģiskajiem, anatomiskajiem un fizioloģiskajiem parametriem, kā arī nosakot mikro RNS (miRNS) 156 un to mērķa gēnu ekspresiju. Noteica arī auksīnu un citokinīnu ietekmi uz tikko ievadītu bērza in vitro dzinumu rejuvenilizāciju. Noskaidroja, ka neoptimāls subkultūras ilgums, paaugstināts slāpekļa un saharozes daudzums, un paaugstināta auksīna un citokinīna koncentrācija veicina nostabilizētu bērza in vitro dzinumu nobriešanu, par ko liecina zemāks morfogēnais potenciāls, palielināta lūksnes platuma attiecība pret stumbra rādiusu, attīstīta periderma, palielināta polifenoloksidāzes aktivitāte, kā arī samazināts miR156_511 un paaugstināts SPL1 ekspresijas līmenis. Savukārt rejuvenilizācijai visoptimālākā ir kokaugu barotne ar zeatīnu 0,5 mg L-1, saharozi 20 g L-1 un 30 dienu subkultūras ilgumu. MiR156 un tā mērķa gēnus SPL1 un SPL9 var izmantot kā molekulāros bērza juvenilitātes marķierus, no kuriem lielākās atšķirības starp juvenīliem un nobriedušiem bērziem novērojamas miR156_511 un tā mērķa gēna SPL1 ekspresijas līmenī. Fizioloģiskie juvenilitātes marķieri, kas sakrīt ar molekulārajiem marķieriem ir augsts morfogēnais potenciāls, samazināta lūksnes platuma attiecība pret stumbra rādiusu, samazināta polifenoloksidāzes aktivitāte, kā arī neattīstīta periderma.

In vitro culture initiation and shoot rejuvenation from birches in their reproductive phase are difficult and often unsuccessful. To date, neither physiological nor molecular markers have been developed to evaluate the degree of juvenility of birch in vitro shoots, which could be used to track rejuvenation process and to determine factors affecting it. The study was carried out with the aim of finding out factors affecting in vitro rejuvenation of silver brich in vitro shoots and to develope physiological and molecular juvenility markers for birch in vitro shoots. The effect of subculture time, nitrogen amd sucrose concentration and different plant growth regulators on stabilized birch in vitro shoot rejuvenation were determined, using morphological, anatomical, physiological parameters as well as expression analysis of micro RNA (miRNA) 156 and their target genes was done. In addition effect of auxins and cytokinins on newly initiated birch in vitro shoots were detrmined It was shown, that suboptimal subculture time, increased nitrogen and sucrose level and increased auxin and cytokinin concentration promotes maturation of stabilized birch in vitro shoots, which is indicated by low morphogenic potential, elevated phloem width ratio to stem radius, developed periderm, increased polyphenoloxidase activity, as well as reduced level of miR156_511 and increased level of SPL1 expression. WPM, zeatin 0,5 mg L-1 medium and 30 day subculture time are the most optimal conditions for rejuvenation. MiR156 and its target genes SPL1 and SPL9 can be used as molecular birch juvenility markers, from which the greatest differences in expression levels between juvenile and mature birches are observed in miR156_511 and its target gene SPL1. Physiological juvenility markers, that correspond with molecular markers are high morphogenic potential, reduced phloem width ratio to stem radius, low polyphenoloxidase activity as well as undeveloped periderm.