Dendrimēri kā luciferāzi saturošas plazmīdas transfekcijas vektori, in vitro un in vivo pētījumi

Abstract

Gēnu terapija ir nozīmīga dažādu ģenētisku slimību ārstēšanai, kā arī DNS vakcīnu attīstībai, taču vēljoprojām limitējošais faktors gēnu terapijas pielietošanai klīnikā ir drošas un efektīvas metodes trūkums, lai DNS ievadītu šūnās. Ir izveidoti dažādi sintētiski vektori, kas ir drošāki par rekombinanto vīrusu metodi, taču tie nav pietiekami efektīvi. Dendrimēri ir viens no sintētiskajiem DNS ievades vektoru veidiem, kam piemīt vairākas priekšrocības salīdzinot ar citām metodēm, un šīs nanodaļiņas pēdējo gadu laikā pastiprināti pētītas gēnu ievadei in vitro un in vivo. Šajā pētījumā tika pārbaudīta četru dažādu dendrimēru – ceturtās paaudzes poli(amidoamīna) PAMAM G4, ceturtās paaudzes katjonu fosfora CPD G4, ceturtās paaudzes katjonu fosfora AE2 G4 un otrās paaudzes katjonu oglekļa-silīcija CBD-CS G2 – spēja saistīties ar plazmīdas DNS (pDNS), lai veidotu dendrimēru-pDNS kompleksus. Papildus tika veikti in vitro transfekcijas efektivitātes un citotoksicitātes pētījumi. Ar bioluminescences metodi tika pētīta arī divu dendrimēru – CPD G4 un CBD-CS G2 – spēja nogādāt DNS šūnās in vivo peļu modelī. No biofizikālās raksturošanas pētījumiem var secināt, ka visi četri dendrimēri spēj saistīt pDNS un veidot stabilus kompleksus. Dendrimērs CBD-CS G2 bija visefektīvākais šūnu transfekcijai, un būtiska citotoksicitāte netika novērota. In vivo pētījumos tika noskaidrots, ka CBS-CS G2 dendrimērs nespēj efektīvi nogādāt DNS šūnās. Pretēji tam, tika novērots, ka veidojot plazmīdas DNS kompleksus ar pieaugošas koncentrācijas CPD G4 denrimēru, bioluminescence pieaug paaugstinoties koncentrācijai. Vislielākā fotonu plūsma tika novērota pelēs, kam tika injicēti kompleksi ar 50 µg CPD G4 dendrimēru. No šiem rezultātiem var secināt, ka CPD G4 dendrimērs no visiem četriem pētītajiem dendrimēriem, ir vispiemērotākais in vivo DNS ievadei šūnās. Transfekcijas efektivitātes uzlabošanai nepieciešams optimizēt dendrimēru-DNS kompleksus.

Gene therapy is a powerful method for treating various genetic diseases and DNA vaccine development, yet, lack of safe and efficient DNA delivery methods still remains the limiting obstacle to human gene therapy. Various synthetic gene delivery agents that are safer than recombinant viruses have been developed, however, they do not possess the required efficacy. Dendrimers are type of synthetic delivery vehicles that exhibit several advantages over other delivery agents, and these nanoparticles have been investigated over past few years for in vitro and in vivo genetic material delivery. In this study, four different dendrimers – generation four poly(amidoamine) dendrimer PAMAM G4, generation four cationic phosphorous dendrimer CPD G4, generation four cationic phosphorous dendrimer AE2 G4 and generation two cationic carbosilane dendrimer CBD-CS G2, were studied to characterize their ability to interact with plasmid DNA (pDNA) and form dendrimer-pDNA complexes. Furthermore, in vitro transfection efficiency and cytotoxicity experiments were performed. Also, the ability of two dendrimers – CPD G4 and CBD-CS G2 – to introduce DNA in vivo in murine animal model was examined using bioluminescence imaging. The results of the biophysical characterization studies indicate that all four dendrimers efficiently bind pDNA and form stable complexes. Dendrimer CBD-CS G2 was the most efficient for cell transfection, and no significant cytotoxicity was observed. In vivo bioluminescence studies showed that CBD-CS G2 dendrimer is not an efficient genetic material delivery vehicle. In contrast, mice treated with pDNA complexed to increasing concentration of CPD G4 dendrimer, displayed bioluminescence in concentration dependent manner, and the highest photon flux was obtained in mice treated with 50 µg of CPD G4. These results indicate that phosphorous dendrimer CPD G4 is the most suitable one of the four investigated dendrimers for in vivo gene delivery, however, increase of transfection efficacy requires further optimization of DNA-dendrimer formulations.