Jaunu ģenētisko variantu funkcionāla raksturošana izmantojot izolētas pacientu šūnas

Abstract

Mutācijas gan mitohondriālajā DNS, gan kodola DNS var izraisīt traucējumus mitohondriju oksidatīvās fosforilēšanas sistēmā, kas var būt cēlonis smagām mitohondriālajām slimībām. Mitohondriālo slimību diagnostika ir komplicēta, un tai izmanto lielu laboratorijas metožu klāstu. Darba “JAUNU ĢENĒTISKO VARIANTU FUNKCIONĀLA RAKSTUROŠANA IZMANTOJOT IZOLĒTAS PACIENTU ŠŪNAS” mērķis ir raksturot jaunus ģenētiskos variantus reto ģenētisko slimību pacientiem, izmantojot molekulārās un bioķīmiskās metodes, kā arī perifēros leikocītus un kultivētus fibroblastus. Tika veikta DNS variantu validācija ar Sangera sekvencēšanu, šūnu līniju izveidošana un kultivēšana, mitohondriju izdalīšana no šūnu kultūrām un perifērajiem leikocītiem, proteīnu koncentrācijas noteikšana, oksidatīvās fosforilēšanas (OXPHOS) sistēmas enzīmu aktivitātes mērījumi, šūnu dzīvotspējas noteikšana, kā arī imūnblotēšana. Vienam pacientam tika apstiprināta HPDL gēna varianta klātbūtne, kas saistīta ar mitohondriālajām saslimšanām. Otram pacientam tika apstiprināti divi PTCD3 gēna varianti. Tika noteikta šī pacienta un viņa ģimenes locekļu, kā arī kontroles grupas OXPHOS sistēmas enzimātiskā aktivitāte fibroblastos, kā arī pētīta varianta ietekme uz PTCD3 proteīna daudzumu mitohondrijos un šūnu dzīvotspēju.

Mutations in mitochondrial DNA and nuclear DNA can cause disorders of the oxidative phosphorylation system, which can lead to severe mitochondrial diseases. The diagnostics of mitochondrial diseases is complicated and involves a wide array of laboratory methods. The aim of the study “FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF NEW GENETIC VARIANTS USING ISOLATED PATIENT CELLS” is to characterize new genetic variants in patients suffering from rare genetic diseases using molecular and biochemical methods as well as isolated peripheral leukocytes and cultured fibroblasts. Study included validation of DNA variants by Sanger sequencing, establishing of fibroblast cell lines, isolation of mitochondria from cultured fibroblasts and peripheral leukocytes, determination of protein concentration, spectrophotometric measurements of oxidative phosphorylation (OXPHOS) enzyme activities, cell viability measurements and immunoblotting analysis. One patient was confirmed to have a variant in the HPDL gene that has been associated with mitochondrial disease. While two variants in the PTCD3 gene were validated in another patient. The enzymatic activities of OXPHOS system protein complexes were determined in cultivated fibroblasts from this patient, his relatives and control group individuals, additionally the effect of these genetic variants on the expression of the PTCD3 protein in mitochondria and cell viability was analyzed.