Rhodotorula toruloides metabolisma inženierija zeaksantīna ražošanai

Abstract

Šajā bakalaura darbā mēģināts ieviest bioloģiski aktīva karotinoīda – zeaksantīna – biosintēzei raugā Rhodotorula toruloides, izmantojot gēnu inženierijas metodes. Zeaksantīna biosintēzei tika izveidoti divi DNS konstrukti ar dažādiem promoteriem, kuri tika veiksmīgi transformēti R. toruloides celmos DSM 4444 un IFO 0880. Tika apstiprināta zeaksantīna sintēzes gēna ekspresija DSM 4444 mutantā, tomēr IFO 0880 mutantā ekspresiju apstiprināt neizdevās. DSM 4444 un IFO 0880 mutantu karotinoīdu ekstraktu analīze, izmantojot plānslāņa un augstefektīvo šķidruma hromatogrāfiju, neuzrādīja zeaksantīna klātbūtni paraugos. Lai uzlabotu zeaksantīna iznākumu, tika izveidots arī DNS konstrukts CIT2 gēna delēcijai, kas novirzītu acetil-CoA plūsmu karotinoīdu sintēzei. Tomēr CIT2 delēcija netika apstiprināta ne vienā, ne otrā celmā. Pētījuma rezultāti liecina par sarežģījumiem, kas saistīti ar zeaksantīna biosintēzes ceļa ieviešanu R. toruloides. Neskatoties uz to, iegūtie dati sniedz vērtīgu ieskatu un pamatu turpmākajiem pētījumiem, lai optimizētu gēnu inženierijas pieejas un efektīvāk veicinātu zeaksantīna ražošanu R. toruloides.

This bachelor's thesis attempts to introduce the biosynthesis of the biologically active carotenoid zeaxanthin in the yeast Rhodotorula toruloides using genetic engineering methods. For the biosynthesis of zeaxanthin, two DNA constructs with different promoters were created and successfully transformed into R. toruloides strains DSM 4444 and IFO 0880. The expression of the zeaxanthin synthesis gene was confirmed in the DSM 4444 mutant, but expression could not be confirmed in the IFO 0880 mutant. Analysis of carotenoid extracts from DSM 4444 and IFO 0880 mutants using thin-layer and high-performance liquid chromatography did not show the presence of zeaxanthin in the samples. To improve zeaxanthin yield, a DNA construct for CIT2 gene deletion, which would redirect acetyl-CoA flow to carotenoid synthesis, was also created. However, CIT2 deletion was not confirmed in either strain. The study's results indicate the complexities of introducing the zeaxanthin biosynthesis pathway into R. toruloides. Despite this, the obtained data provide valuable insights and a basis for future research to optimize genetic engineering approaches and more effectively promote zeaxanthin production in R. toruloides.