Propīdija monoazīda polimerāzes ķēdes reakcijas (PMA-PCR) pielietojums saimniekaugu DNS koamplifikācijas ierobežošanai baktēriju diagnostikā

Abstract

Augu mikrobioma izpētē bieža problēma ir saimniekauga DNS koamplifikācija, kas samazina baktēriju DNS sekvencēšanas precizitāti. Tādēļ NGS izmantošana fitosanitārajā diagnostikā ir ierobežota, lai gan tā spēj sniegt detalizētu pārskatu par visu augu mikroorganismu sastāvu. Šī pētījuma mērķis bija izvērtēt propīdija monoazīda (PMA) pielietojumu saimniekauga DNS apspiešanai, izmantojot qPCR un NGS metodes. Pētījumā salīdzinātas trīs paraugu priekšapstrādes metodes – sasaldēšana, ultraskaņa un enzīmu apstrāde , lai panāktu selektīvu augu šūnu bojāšanu un padarītu tās jutīgākas pret PMA. Visefektīvākā metode bija sasaldēšana pie –20 °C, kas kombinācijā ar PMA būtiski samazināja augu DNS koamplifikāciju. Salīdzinājumā ar alternatīvām metodēm, PMA-PCR uzrādīja lielāku jutību un mazāku ietekmi uz baktēriju DNS. NGS rezultāti apliecināja, ka šī pieeja būtiski palielina baktēriju nolasījumu īpatsvaru un identificējamo taksonu skaitu. PMA-PCR ir efektīva metode, ko iespējams izmantot augu patogēnu diagnostikā arī gadījumos, kad saimniekauga genoms nav zināms.

A common problem in plant microbiome research is the co-amplification of host plant DNA, which reduces the accuracy of bacterial DNA sequencing. Therefore, the use of NGS in phytosanitary diagnostics is limited, although it can provide a detailed overview of the entire microbial composition in plant material. The aim of this study was to evaluate the application of propidium monoazide (PMA) for the suppression of host DNA using qPCR and NGS methods. Three sample pretreatment methods—freezing, ultrasound, and enzymatic treatment—were compared to selectively damage plant cells and make them more susceptible to PMA. The most effective method was freezing at –20 °C, which, when combined with PMA, significantly reduced plant DNA amplification. Compared to alternative methods, PMA-PCR demonstrated higher sensitivity and less impact on bacterial DNA. NGS results confirmed that this approach significantly increases the proportion of bacterial reads and the number of identifiable taxons. PMA-PCR is an effective method for plant pathogen diagnostics, even in cases where the host plant genome is unknown.