Jaunu Staphylococcus Epidermidis sortāzes A inhibitoru atlase izmantojot FRET skrīninga sistēmu

Abstract

Pētījuma mērķis ir atrast jaunus zāļu kandidātus, kuri spēj inhibēt Staphylococcus epidermidis sortāzi A, vienlaicīgi mazinot patogēnu multirezistēnces izplatīšanos. Šim mērķim tika izveidoti ģenētiski DNS konstrukti, kuri kodē S.epidermidis sortāzes A katalītisko domēnu, iebūvējot pET22b un pET28a vektoros srtA gēnu. Rekombinantā sortāzes proteīna sintēze tika inducēta ar IPTG, izmantojot BL21(DE3) celmu Escherichia coli ekspresijas sistēmā. Proteīns bez papildus heksahistidīna sekvences (pET22b vektors) tika attīrīts ar anjonapmaiņas hromatogrāfijas kolonnām, savukārt heksahistidīna sekvenci saturošā sortāze (pET28a vektors) tika attīrīta izmantojot metāla afīno un gelfiltrācijas hromatogrāfiju. Enzīma aktivitāte un inhibitoru potence tika analizēta ar FRET analīzi, izmantojot Abz-LPETG- K-(DPN) un Dabcyl-LPETG-Edans fluorescenti iezīmetos peptīdus. Pavisam tika izanalizēti 1600 savienojumi, no kuriem 23 demonstrēja 50% vai lielaku relatīvo Se- SrtA inhibīšanu. Savukārt pēc sekundāras atlases tikai 15 savienojumi uzrādīja >50% relatīvo enzīma inhibēšanu. No šīs atlasītās inhibitoru grupas tālākiem pētījumiem tika atlasīti 4 savienojumi, kuri uzrādīja vislielāko relatīvo rezistenci. Darba turpinājumā ir paredzēti tādi tālāki izmeklējumi kā KMR, citotoksicitātes un šūnu invāzijas testi, lai varētu pāriet uz preklīniskiem pētījumiem in vivo līmenī.

This study aimed to find novel drug-like compounds for inhibition of sortase A from Staphylococcus epidermidis to prevent the formation of multi-resistance. For this purpose, the DNA construct encoding the catalytic domain of S. epidermidis sortase A has been created by inserting the sortase A gene into pET22b and pET28a vectors. Proteins have been expressed by IPTG induction in Escherichia coli system (BL21). A non-tagged Sortase A (expressed in the pET22b vector) has been purified by anion exchange while His6-tagged Sortase A (expressed in the pET28a vector) has been purified by immobilized metal affinity and size exclusion chromatography. The activity of the enzyme and the potency of its inhibitors have been determined using FRET analysis (Tecan Infinite 200 PRO) measuring fluorescence of Abz-LPETG-K-(DPN) and Dabcyl-LPETG-Edans (GL Biochem) peptide cleavage products. As a result, the sortase A gene has been successfully inserted into pET28a and pET22b vectors to express His6-tagged and non-tagged sortase A, respectively. In total, 1600 drug-like compounds have been screened using FRET analysis. The preliminary screening resulted in selecting of 23 compounds, that have shown >50% of relative inhibition of Se-SrtA protein. To reduce false-negative results further studies have been done to measure the confidence interval. During the next screening phase, only 15 compounds have shown the similar result. Finally, 4 compounds with the significant relative inhibition of Se-SrtA have been selected for NMR as well as cytotoxic and cell invasive studies to proceed to further in vivo studies.